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Categoría: Entomología forense

Entomología forense y ADN. ¿Cómo identificar especímenes? Club de Ciencias Forenses

Amigos del Club de Ciencias Forenses, esta semana presentamos el artículo “DNA Barcoding in Forensic Entomology – Establishing a DNA Reference Library of Potentially Forensic Relevant Arthropod Species” de Chimeno, C.; Morinière, J.; Podhorna, J.; Hardulak, L.; Hausmann, A.; Reckel, F.; Grunwald, J. E.; Penning, R. y Haszprunar, G. (2018), sobre entomología forense y ADN, en el cual se explica el sistema de secuenciación de ADN para crear bancos o bibliotecas genéticas y su aplicación a las especies entomológicas de utilidad forense.

Una de las tareas más importantes de la ciencia forense es determinar el intervalo postmortem de un individuo (cuándo murió). Esta labor se dificulta pasadas 72 horas, cuando el cuerpo se encuentra en estados de descomposición más avanzados. Sin embargo, existe una disciplina necesaria en dichas circunstancias: la entomología forense.

Debido a que se supone que la colonización por artrópodos de una fuente de carroña coincide bastante con el comienzo de la muerte, un entomólogo forense puede estimar ese intervalo, siempre que se haya podido producir la colonización. Esta estimación puede lograrse mediante el estudio de las muestras de artrópodos procedentes del cuerpo en descomposición.

Así, para hacer un buen estudio el primer paso recae en hacer una identificación correcta y exacta de las especies. Sin embargo, esto puede resultar todo un reto si los entomólogos sólo cuentan con restos parciales de los artrópodos como la exuvia (exoesqueleto), extremidades o biomasa no identificada.

Incluso los especímenes intactos representan una gran carga cuando se desea aplicar métodos morfológicos, ya que los huevos, los estadios larvarios tempranos y, a veces, incluso los posteriores de muchas especies diferentes comparten características similares. Esto hace que sea casi imposible en ciertos grupos, incluso para especialistas, distinguir entre ellos basándose solo en la morfología. Para dar solución a estas situaciones, lo que muchas veces se hace es criar los especímenes hasta que alcanzan una fase en la que sus características ya son distinguibles.

Por tanto, ¿qué alternativas existen para solventar estas dificultades?

La aplicación de la biología molecular en la entomología forense ha ganado importancia, pues ofrece innumerables nuevas posibilidades en el análisis de artrópodos. Las secuenciaciones de ADN emplean una secuencia genética corta como un único identificador para diferenciar entre especies. De hecho, pueden aplicarse a pequeñas cantidades de biomasa de artrópodos desconocidos.

No obstante, la calidad de los resultados de este método depende de la base de datos de referencia usada para la comparación de secuencias. El establecimiento de una base de datos de secuenciación de ADN de referencia de alta calidad es, por lo tanto, un requisito previo importante cuando se desea garantizar resultados precisos.

Así pues, en el marco de la campaña Secuenciación Vital Internacional, desde 2009 se ha construido una biblioteca de referencia de secuenciación de ADN de aproximadamente 20.000 especies animales representadas por más de 250.000 especímenes. Esta biblioteca de referencia de secuenciación de ADN permite un estándar muy alto de identificación precisa de especies, siendo la más completa para artrópodos, incluidos coleópteros, himenópteros, lepidópteros…

Así las cosas, los autores del artículo querían demostrar la aplicación de dicha biblioteca utilizándola como columna vertebral de un análisis de secuenciación de alto rendimiento (SAR) administrado a muestras a granel o especímenes de artrópodos obtenidos de cadáveres humanos.

Para ello, investigaron un total de 1392 especies de artrópodos, estando el 96% de ellos conservados en etanol. Estos se originaron en diferentes localidades (de República Checa principalmente) y experimentos previos, recolectados desde 2008 a 2015. Los especímenes provenían de cerdos, pájaros y ratas, estando la mayoría de ellos en fases avanzadas.

Estos especímenes se utilizaron para el establecimiento de una biblioteca de referencia forense. Las muestras a granel no estaban destinadas a la construcción de la biblioteca de referencia. Su análisis simplemente sirvió como ejemplo de aplicación de la tecnología de metasecuenciación.

Se seleccionaron de una a tres muestras de cada morfoespecie designada para transferirlas a 96 microplacas. Se extrajo una pequeña muestra de tejido muscular de especímenes grandes. El espécimen completo se utilizó para individuos pequeños, como ácaros, larvas pequeñas y huevos. La extracción consecutiva de ADN genómico se realizó con protocolos de secuenciación estándar.

Las secuencias recibidas se ensamblaron, respectivamente, se editaron y se alinearon entre sí para realizar más correcciones. Al actualizar las secuencias de códigos de ADN editadas y los archivos de rastreo en la base de datos, se adquirieron los números de índice de códigos de secuenciación de las especies. Así pues, a las secuencias se les asigna un identificador global único.

Todos los metadatos, incluidos los nombres de las especies, las imágenes, las referencias, así como las regiones y los países de origen, se proporcionaron para cada espécimen.

En resumen, de todas las especies procesadas (1392), 678 generaron secuencias de códigos. Se definieron un total de 502 secuencias como códigos exitosos para su uso en la biblioteca forense. De estos, se dio cobertura para 88 especies de artrópodos diferentes que pertenecen a 28 familias, de 7 órdenes distintos. El éxito de la secuenciación fue mayor para las muestras recién recolectadas de 2014 y 2015.

Por otro lado, 44 especímenes fueron identificados a nivel de familia o género solamente. La mayoría de especies identificadas eran del orden de los dípteros, entre los que los califóridos presentaban más abundancia y biodiversidad. El segundo orden más abundante fue el de los coleópteros. El resto de especies, aunque presentes en la biblioteca, estaban representados por un menor número de especímenes.

Asimismo, de esos 502 especímenes se pudo asignar un número único de identificación global a 436. A todos los coleópteros se les pudo clasificar exitosamente, pero solo al 87% de los dípteros se les asignó su número.

Para concluir, con una biblioteca de referencia sólida a mano, la aplicación de SAR es innovadora. Esto es debido a que permite el análisis de cientos y miles de individuos, así como la generación de grandes conjuntos de datos que luego pueden evaluarse a voluntad. En futuras aplicaciones, podrá trabajarse con este método en proyectos a gran escala.

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Lucilia Silvarum: una nueva especie de interés para la entomología forense en Europa. Club de las Ciencias Forenses.

Lucilia Silvarum. Club de las Ciencias Forenses

Lucilia Silvarum. Club de las Ciencias Forenses

Apreciados amigos del Club de las Ciencias Forenses, el artículo que hoy les ofrecemos nos presenta a una nueva especie para la entomología forense, la Lucilia Silvarum. Este interesantísimo artículo lo debemos a Heike Fremdt, Richard Zehner, Jens Amendt, todos ellos pertenecientes a la Universidad Johann Wolfgang Goethe en Frankfurt (Alemania), a Krzysztof Szpila de la Universidad Nicolaus Copernicus en Torun (Polonia), a Johannes Huijbregts del Centro de Biodiversidad Naturalis (Holanda) y a Anders Lindström perteneciente al Instituto Nacional de Veterinaria de Uppsala (Suecia).

Como sabemos, la entomología forense es el estudio de insectos y otros artrópodos asociados con cadáveres, que se utiliza, entre otros propósitos, para estimar el tiempo transcurrido desde la muerte o intervalo postmorten y la identificación de los posibles traslados del cuerpo, así como las características de las zonas de procedencia.

Existen dos métodos para determinar el tiempo transcurrido desde la muerte usando la evidencia de los artrópodos, el primero utiliza la edad y tasa de desarrollo de larvas; el segundo método utiliza la sucesión de artrópodos en la descomposición del cuerpo. Ambos métodos se pueden utilizar por separado o conjuntamente siempre dependiendo del tipo de restos que se están estudiando. Por lo general, en las primeras fases de la descomposición las estimaciones se basan en el estudio del crecimiento de una o dos especies de insectos, particularmente dípteros, habiéndose convertido la Lucilia Silvarum en una de las especies de mayor importancia para la entomología forense. Así, la Lucilia Silvarum es una mosca de la familia Calliphoridae (moscas carroñeras, moscardones, greenbottles o moscas de grupo) del orden díptera. Esta mosca fue descubierta por primera vez por Johann Wilhelm Meigen en 1826 y se encuentra sobre todo en Europa. Hasta cuatro especies, L. ampullacea, L. caesar, L. illustris y L. sericata, se encuentran regularmente en cadáveres humanos en Europa. A pesar de la importancia de la entomología dentro de la disciplina forense, todavía, a día de hoy, no tenemos un conocimiento completo de la biología y el desarrollo de la mayoría de estas especies. Esto es debido a que la cría artificial de las moscas en el laboratorio no es fácil y, además, la identificación de determinados marcadores moleculares en las etapas inmaduras es complicada y costosa.

Con todo, para el desarrollo del estudio entomológico, y cuando el objetivo es realizar estimaciones de intervalo post-mortem utilizando la L. Silvarum, se necesitan datos de generación de calor .El primer paso es la identificación precisa por medios morfológicos y moleculares. De esta manera, es esencial disponer de la máxima información posible relacionada con la biología y el desarrollo de las moscas azules necrófagas, así como identificar correctamente los individuos de la muestra. Como hemos apuntado, hasta el momento actual la L. Silvarum no tenía una especial importancia en la entomología, pero se ha convertido en la actualidad en un elemento entomológico de investigación clave, sobre todo en la tercera etapa larval. Para su identificación, incluso en los casos más difíciles, se está utilizando el marcador mitocondrial Citocromo Oxidasa I (COI).

Los autores del presente artículo recogen tres casos forenses de diferentes países europeos que han informado, por primera vez, de L. Silvarum en cadáveres humanos que fueron encontrados cerca de lagos, pantanos o riberas. El primero de los casos se produjo el 13 de julio de 2008, cuando un hombre fue encontrado muerto en una playa, en una zona industrial a las afueras de una ciudad de Suecia. Al día siguiente, y durante la autopsia, se recogieron larvas. Nourteva, a lo largo de sus estudios entomológicos, señaló que se necesitan 26 días para el desarrollo desde el huevo hasta el adulto de la L. Silvarum, a una temperatura media de 16,6ºC. Suponiendo que el tiempo para alcanzar el tercer estadio es de aproximadamente el 20% del total de tiempo de su desarrollo (como la mayor parte de las moscas azules), tardaría, en el caso forense que nos ocupa, un mínimo alrededor de 5 días. Así pareció confirmarse según los testigos que vieron por última vez a este hombre con vida. Había fallecido por causas naturales.

El segundo de los casos se produjo en agosto de 2008, cuando un hombre fue encontrado muerto cerca de Amsterdam, en las aproximaciones de una zona con abundante agua dulce. Se trataba de un fallecimiento por sobredosis. Su cabeza estaba repleta de larvas en el segundo y tercer estado, de L. Silvarum, L. Illustris y L. Ampullacea. No se podía llevar a cabo una estimación muy estable al no disponer de información sobre su desarrollo larvario a diferentes temperaturas. Con todo, se estimó en, aproximadamente unos 5 días, desde el estado de larva hasta llegar a la longitud del gusano más grande encontrado (12mm), a una temperatura media de 20ºC.

En el tercer caso, mayo de 2009, se trató del cuerpo de una mujer de 67 años, localizada en un campo de grano cerca de Gütersloh (Alemania). Había sido vista con vida 3 días antes, en una granja cercana a la escena del crimen. La autopsia determinó que fue el estrangulamiento la causa de su muerte y el médico forense determinó que había fallecido entre 8 y 24 horas antes del descubrimiento del cadáver. Se encontraron dos larvas de L. Silvarum en su boca. El estudio realizado llevó a la determinación de que fue asesinada en su camino de vuelta a casa, tras una fiesta en la granja vecina. Este caso sigue abierto.

Con todo, las moscas de estudio se obtuvieron de cadáveres humanos, utilizando cebo mixto de carne de hígado de vacuno y dimetil trisulfuro. Las muestras se almacenaron al 95% de EtOH. Dos patas fueron analizadas de cada muestra, y se llevó a cabo la extracción de ADN.

Por otra parte, los autores del presente estudio nos muestran la clave de identificación para la L. Silvarum, dotándonos de un excelente material entomológico para la identificación morfológica de larvas de tercer estadio en moscardones europeos.

Club de las Ciencias Forenses

Traducción: Nahikari Sánchez

Edición: Belén Alcázar